Bibliotekę Ambrozjańską w Mediolanie założył 7 września 1607 roku kardynał Federico Borromeo, bratanek św. Karola Boromeusza. Była to jedna z pierwszych bibliotek publicznych, zgodnie z pragnieniem kardynała, by dać do książek dostęp wszystkim, którzy potrafią czytać i pisać. Miało to być także swego rodzaju centrum nauki i kultury. W ramach biblioteki zaczęły działać inne instytucje m.in. Collegio dei Dottori, Pinacoteca i Accademia del Disegno, zajmująca się nauczaniem malarstwa, rzeźby i architektury. Pierwszy czytelnik przekroczył progi Ambrozjany 8 grudnia 1609 roku.
Biblioteka ta jest do tej pory jedną z najważniejszych bibliotek na świecie. Jej zbiory liczą ponad milion woluminów drukowanych (w tym tysiące inkunabułów i ksiąg z XVI wieku); prawie 40 000 rękopisów (w tym słynny Codex Atlanticus Leonarda da Vinci) w języku włoskim, łacińskim, greckim, arabskim, syryjskim, etiopskim (i wielu innych); 12 000 rysunków (wśród nich dzieła Rafaela, Pisanello, Leonarda i innych uznanych mistrzów); 22 000 rycin; oraz inne unikatowe mapy, rękopisy nutowe, pergaminy i papirusy. Fryderyk Boromeusz nadał Bibliotece charakter wielokulturowy, nastawiony na dialog, pisząc m.in. „nawet książki z kultur i wyznań innych niż chrześcijańskie mogą przynieść nam wiele korzyści i sprawić, że poznamy wiele rzeczy pięknych i bardzo pożytecznych”.
W Pinakotece podziwiać można jedno z dwóch dzieł Leonarda, które są w Mediolanie. To obraz na desce przedstawiający portret mężczyzny. Uważano długo, że to autoportret lub też wizerunek Ludovico il Moro, księcia Mediolanu. W 1905 roku, kiedy konserwatorzy usunęli przemalowanie i odsłonili dłoń z papierem nutowym w dolnej części, zasugerowano, że jest to portret muzyka. Być może przedstawia Franchina Gaffurio, mistrza z katedry lub francusko-flamandzkiego kompozytora Josquina des Prez, obaj pracowali w Mediolanie w tamtych. Ostatnio uczeni doszli do wniosku, że być może jest to portret przyjaciela Leonarda – Atalante Migliorottiego, toskańskiego muzyka z dworu książęcego.