Kościół pw. św. Anny wraz z sąsiednim kościołem i klasztorem oo. bernardynów tworzy spójny kompleks. Tak opisał go Józef Ignacy Kraszewski.

[…] maluczki a drobny, jest cackiem przedziwnem, jakby jedną z tych monstrancji gotyckich, z wieżyczek, pręcików i nitek złotych zbudowaną, jakie jeszcze gdzieniegdzie po starych spotykamy kościołach.

Kwestią do dziś nie do końca ustaloną jest wskazanie fundatora kościoła św. Anny i autora jego projektu architektonicznego. Według XIX‑wiecznych historyków za powstanie świątyni odpowiedzialny miał być Wielki Książe Litewski Witold i jego żona Anna. Opinia ta konkurowała z teorią głoszącą, iż kościół powstał z inicjatywy króla Zygmunta Augusta i miał być przeznaczony na mauzoleum dla jego żon – Elżbiety Austriaczki i Barbary Radziwiłłówny. Najpowszechniej przyjął się jednak pogląd, iż kościół został ufundowany przez Aleksandra Jagiellończyka, na przełomie  XV i XVI w. 

Podobnie niejasna jest sprawa ustalenia tożsamości budowniczego obiektu. Przez większość badaczy za autora projektu uważany jest pochodzący z Gdańska Michał Enkinger, wykonawca m.in. kościoła pw. św. Franciszka i św. Bernarda, który sąsiaduje z kościołem św. Anny, czy Domu Perkuna w Kownie. Ale pojawiają się też głosy wskazujące innych kandydatów m.in. nadwornego architekta Władysława Jagiellończyka, pochodzącego z Pragi Benedykta Rejta – autora Sali Władysławowskiej na Hradczanach. 

Przez pewien czas w XVI w. kościół pw. św. Anny znajdował się w rękach protestantów. W 1581 r. po zakończeniu odbudowy, po trawiących go w latach 60. pożarach, został oddany zakonnikom z pobliskiego klasztoru bernardynów. Na początku XVII stulecia przy północnej ścianie prezbiterium dobudowano zakrystię i galerię łączącą te dwa budynki. Ponownie kościół uległ pożarowi w 1794 r. W jego wyniku pojawiły się rysy i spękania na sklepieniu, ścianie południowej i fasadzie. Naprawiono je tymczasowo, dokonując wymiany żelaznych wzmocnień wg projektu architekta Michała Szulca. Wówczas również zamurowano dwa boczne wejścia do kościoła. W 1872 r. przed kościołem powstała neogotycka dzwonnica projektu rosyjskiego architekta Nikołaja Czagina. Pomiędzy nią a świątynią rozciąga się mur z bramą wiodącą na dziedziniec sąsiedniego kościoła bernardynów.

O ile wygląd zewnętrzny kościoła pw. św. Anny nie uległ na przestrzeni wieków znacznym przekształceniom i daje dobre wyobrażenie o pierwotnym kształcie świątyni, o tyle wystrój jego wnętrza to w większości kreacja z początku XX w. Powstał w trakcie prowadzonej w latach 1902-1909 kompleksowej renowacji świątyni realizowanej przy współpracy specjalistów z Wilna, Krakowa i Warszawy.

Wnętrze kościoła pw. św. Anny w Wilnie (fot. M. Osip-Pokrywka)

Ze względu na katastrofalny stan techniczny obiektu w 1902 r. utworzono komitet mający na celu gromadzenie środków i określenie kierunku jego restauracji. Pierwszym prezesem komitetu został marszałek gubernialny wileński Adam hr. Broel-Plater. Na kierownika przedsięwzięcia konserwatorskiego mianowano warszawskiego architekta Józefa Piotra Dziekońskiego. W naukowym opracowaniu kierunku działania wspomagał go Sławomir Odrzywolski konserwator zabytków gotyckich z Krakowa. Do prac technicznych, mających na celu wzmocnienie konstrukcji kościoła, zaangażowano grupę miejscowych inżynierów i architektów: A. Antonowicza, M. Hattowskiego, K. Falewicza, K. Girdwainisa.

Choć prace prowadzone były zgodnie z obowiązującymi ówcześnie naukowymi zasadami konserwacji i w taki sposób, „ażeby pierwotny kształt budowy nie uległ żadnej zmianie, ślady zaś nieudolnych i niezgodnych z gotyckim stylem restauracji mogą być usunięte”, to pod wieloma względami oceniane są negatywnie. Wątpliwość budziło m.in. wykonanie nowego sklepienia nad nawą (pierwotnie kościół pw. św. Anny był budowany bez, a te istniejące miały negatywnie wpływać na wytrzymałość obiektu). Sklepienie nad chórem i prezbiterium rozebrano i ściśle odtworzono, natomiast nad nawą zastąpiono nowym, zaprojektowanym przez Dziekońskiego. Prace objęły również: podmurowanie fundamentów, pogrubienie ścian i wzmocnienie całości konstrukcji systemem ściąg żelaznych. Odtworzono zamurowane portale boczne w fasadzie i ufundowano nowe drzwi zewnętrzne, które w 1908 r. zostały odkute w Warszawie. Na zewnątrz kościół pomalowano jaskrawą czerwoną farbą, która na szczęście do dziś zbladła, uwidaczniając naturalny kolor cegły. Wówczas powstała również większość wyposażenia kościoła: prospekt organowy, ambona i konfesjonały. Spośród wcześniejszych elementów wystroju szczególnie cenne są trzy barokowe ołtarze (główny z obrazem św. Anny Samotrzeć i dwa boczne) zaprojektowane w 1747 r. przez architekta Jana Krzysztofa Glaubitza.